Трансгенді тышқандар: алу және пайдалану әдістемесі

Зерттеудің өзектілігі. Трансгендік технология әзірленді және жетілдірілді зертханалық мышах. Басынан бастап 1980-ші жылдары әр түрлі желісі тышқандар енгізілді жүздеген гендердің. Бұл зерттеулер белгілі бір дәрежеде ықпал етті белгілеу тетіктерін гендік реттеу және дамыту, ісіктер, табиғат иммунологиялық ерекшелігін, молекулалық генетика, өсу және даму, басқа да іргелі биологиялық процестер. Трансгендік тышқандар рөл атқарды зерттеу мүмкіндіктері ірі ауқымды синтез дәрілік заттардың, сондай-ақ құру трансгенді желілерді модельдеуге мүмкіндік беретін әр түрлі генетикалық аурулар.
Зерделеумен қатар іргелі мәселелерді трансгенеза көп көңіл тартады құру бойынша жұмыстар трансгенді продуцент-жануарларды рекомбинантты белоктар, трансгенді ауыл шаруашылығы жануарларын төзімді, аурулар немесе трансгенді жануарлар бар жақсартылған өнімділік сапалары.
Гендік инженерия және трансгеноз атап айтқанда — сверхсложные ғылым саласы қазірдің өзінде көп нәрсеге қол жеткіздік, бірақ олардың даму көкжиегі шексіз. Олар мүмкіндік береді сұға қасиетті негіздері біздің өмір түсіну үшін, ең болмағанда ішінара) механикке өмір сүру молекулалық деңгейде.
Гендік инженерия әдістерімен алдымен алынды трансгендік микроорганизмдер әкелетін бактериялар гендер мен гендер онкогенного вирус маймылдар, содан кейін — микроорганизмдер, тірек өзіне гендер дрозофилы, қоян, адам және т. б.
Кейіннен алдық микробный синтезі көптеген биологиялық белсенді заттардың қатысып отырған ұлпаларында жануарлар мен өсімдіктердің өте төмен шоғырлануы: инсулин, интерферон, адамның өсу гормоны адам, » гепатитіне қарсы вакциналарды, сондай-ақ ферменттер, гормональдық препараттарды, моноклоналды антиденелерді және т. б.
Шыңы даму гендік және клеткалық инженерияның қазіргі уақытта алу болып табылады трансгенной тышқандар, қоян, шошқа, сиыр және басқа да бірқатар; жануарларды клондау бақалар, тышқандар, қой. Барлық жақын қолайлы биология жұмысқа адам геномом, клонированию адам.
Мақсаты осы жұмыс саяды зерттеу ұғымдар трансгеноза, зерттеу әдіснамасы алу трансгенді тышқандар және оларды қолдану.
Зерттеу объектісі болып табылады трансгендік тышқандар.

1. ТҮСІНІГІ ТРАНСГЕНОЗА
гендік инженерия трансгеноз тышқан
Организмдер мен олардың геноме жүзеге асырылды өзгерту жолымен парасексуальных операциялар деп атайды трансгенными, әдіснамасы, ол пайдаланады трансгенді жануарлар деп аталады трансгенозом.
Жалпы түрде трансгеноз ретінде айқындалуы мүмкін ауыстыру гендердің бір ағзаның басқа арқылы операцияларды in vitro. Трансгеноз, және кез келген бағыт ғылымда, болып табылады өте қызықты да тереңдету үшін іргелі қасиеттері туралы түсініктерін тірі ағза, сондай-ақ тікелей практикалық қажеттілігін, оларды қалай түсінеді қазіргі заманғы қоғам.
Бүгінде трансгеноз айналды стратегиялық зерттеу бағыты, — деп жауап береді көптеген іргелі мәселелер. Мысалы, трансгеноз ұсынады әмбебап әдістемелік көзқарас зерттеу жекелеген сатыларын күрделі многостадийных процестер. Бұл әкелуі мүмкін диаграммалар құру, ол сипаттайды бұл желі, конденсаторы, карталар, метаболиттік жолдарын сипаттайды реттілікпен биохимиялық түрлендірулер. Бірақ барлық сатысында әдістерін әзірлеу және жинақтау жұмысы туралы ақпаратты әр түрлі жүйелердің ағзадағы. Арқылы трансгеноза болады вникнуть онда деңгейінде де, бүкіл ағзаның жұмыс істейді промоторы, энхансеры, әсер ету механизмі транскрипционных факторлардың рөлі метилирования ДНҚ мүмкін зерттеу тетіктері әсерін орналасқан. Қолданыс табады трансгеноз және иммунология, эмбриогенеза және зерттеулер дамуы жүйке жүйесі мен тетіктерін қан және ангиогенеза және зерттеуде анықтайтын факторлардың өсуі және саралау мультипотентных дің жасушаларын және, ақырында, канцерогенез. Бұл зерттеу онкогенов, онда ол әкелуі мүмкін өзара түсінуге бағытталған выбор судьбы жасушалар процесінде жасушалық дифференциалдау. Басқаша айтқанда, трансгеноз түсінуге көмектеседі, клетка жүзеге асырады таңдау: қалып, оған тыныштық күйде бөлісуге, немесе өлуге.
Трансгендік жануарлар — бұл индивидуумы, геном олардың жасанды түрде енгізілген қосымша генетикалық ақпарат (трансген). Мұндай ақпарат дегеніміз не жеке учаске ДНК меншікті (гомологичными) реттеуші последовательностями (эукариотическая транскрипционная бірлік), не жасалынған ірімшік әр түрлі молекулалардың ДНК гибридті (рекомбинантты) ген. Осылайша, трансген — бұл жасанды түрде енгізілген және интегрировавшийся ДНК жануарлардың чужеродный ген. Тағы бір термин бар, ол сондай-ақ жиі пайдаланылады осы шолуда, бұл трансгенез. Астында трансгенезом түсінеді процесс переноса және интеграция чужеродной генетикалық ақпаратты геном жануарлар.
Генетикалық жетілдіру жануарлардың негізделеді, негізінен, мутационной өзгергіштік, сондай-ақ комбинационной өзгергіштік, сатылатын кезде скрещивании әр түрлі тұқымдары мен популяцияларының жануарлар. Дамыту молекулалық биология, молекулалық генетика және гендік инженерия жасады мүмкін генетикалық модификацияға жануарларды енгізу арқылы олардың геном жаңа гендердің (трансгендік жануарлар).
Жаңа тиімді әдістерін гендерді тасымалдау эмбриональные және соматикалық жасушалары, жануарлар, сондай-ақ қолда барларын жетілдіру тәсілдерін және бүгінгі күні өзекті болып қалуда міндет әлемдік биологиялық ғылым.
Арқасында трансгенозу қазірдің өзінде алынған бағалы туралы ақпарат гендер иелерінің (master-regulatory genes), үшін жауапты реттеу жұмыс істеу үлкен гендердің топтары. Мысалы, сияқты myo реттейтін белсенділігі тобы гендердің спецификалық бұлшық.
Кезінде трансгенозе туындайды бірқатар байланысты проблемаларды механизмдерін келісілген өзара іс-қимыл гендер мен олардың өнімдерін жағдайларда гендер экспрессируются бір типтегі жасушалар, ал олардың өнімдері жұмыс істейді басқа жасушалар. Жиі бұл ретте индуцируется экспрессия басқа гендердің арқылы жөнелту және қабылдау межклеточных сигналдар — мессенджеров — пайда тұтас каскадтар өзара тәуелді индукций және ингибирований. Анықтау үшін механизмдерін, осындай күрделі процестердің пайдаланылады екі көзқарас, олар көрінуі логикалық противоположными.
Олардың бірі болып табылады деген сөздер алып тасталсын — «нокаутировать» — екеуі де аллеля белгілі бір геннің және қалай көруге тіршілік иесі-дәрмектерді оның өнімдері. Бұл тәсіл әдісі деп атайды жоғалту функциялары (loss function).
Басқа тәсіл — керісінше, ойланады, ол ағзаға енгізіп, ген, ол жұмыс істейді және жауап синтезі біраз өнімнің, бірақ бұл өнім нәрсе нехарактерен ағза үшін. Бұл деп атайды әдістермен алу функциясын (gain function). Бұл соңғы әдістері болады өз кезегінде подразделить үш түрлері. Бір әдістерін пайдаланады, анықтау үшін сонымен қатар, болады, егер қалыпты ген қалыпты құрылымы бастайды дұрыс емес реттелуі. Басқа — бұл жүреді, ол ген өз құрылымын өзгертеді, айналады мутантным, дегенмен болып қалады астында қалыпты бақылаумен. Үшінші — бұл жүреді, егер енгізіп, ген, ерекше осы ағза.
«Трансгенозе бөлуге болады үш қиын кезеңнен тұрады: интеграция трансгена, оның экспрессия және трансмиссия, яғни ауыстыру арқылы жыныс жасушалары ұрпағы.
Қысқаша сипаттау схемасы, ол қазір де пайдаланылады көптеген тәжірибелер жасау бойынша трансгендік организмдер.
Арқылы шағылыстыру тышқандарды әр түрлі желілерді алады ұрықтандырылған зиготы. Алдында бірігуі әйел мен еркек пронуклеусов «зиготу, аталық пронуклеус (ол) арқылы микроинъекции енгізеді ДНК, ол келеді встроить» геном. Өңделген осындай тәсілмен зиготы инкубациялайды СО2-инкубаторы. Содан кейін олардың подсаживают жатырға ложнобеременной ұрғашы тышқан. Ол ұрпақ әкеледі, ол болуы мүмкін трансгенным, егер микроинъецированная ДНК монтировалась » геном арқылы рекомбинации. Принципті кезінде трансгенозе болып табылады трансмиссия — мұрагерлік енгізілген генетикалық ақпараттың ұрпақтары трансгенного жануарлар. Трансгенді ұрпақ (олар гетерозиготные бойынша введенному гену) скрещивают с гомозиготными мышами алады генерациялау үшін F1, жартысы гетерозигот. Содан кейін скрещивают өзара гетерозигот ұрпақ F1 алады гомозиготных бойынша введенному гену тышқандар.
Пайда болған сәттен бастап трансгенной технологиялары 80-жылдардың басында көптеген жануарлардың алынды жолымен микроинъекций: трансгендік тышқандар, нематодтар, дрозофилы, теңіз ежи, бақалар, және қарапайым ауыл шаруашылық жануарлары: шошқа, қой, қоян, сиыр, құс және балық.
Микроинъекции жасалады пронуклеус оплодотворенного мышиного жұмыртқа. Мұндай әдісі, әдетте, көптеген молекулалардың ДНК ұйымдастырылған тандемы үлгідегі басы-хвосту («head to tail», соңында бір молекуласының пристраивается басында басқа), ассоциируют алдында интеграцияны арқылы рекомбинаций және встраиваются бір орын хромосомада. Принциптік артықшылығы микроинъекций ерекшелігі, олар мүмкіндік береді тиімді құруға трансгендік жануарларды, бірақ бұл әдіс және елеулі жетіспеушілігі: енгізуге болмайды гендер жасушаның одан кейінгі сатыларында, интеграция процесінде жүреді көптеген қайта топтаудың, геноме көрсетіледі көптеген көшірмелерін ДНК, встраивается, және, сайып келгенде, интеграция жүреді кездейсоқ түрде, өз бетімен орын геномның.
Енгізу үшін инородной ДНҚ-ның геном жануарлар дүниесін пайдалануға болады рекомбинантты ретровирусы. Артықшылықтары ретровирусов болып табылады интеграция бұл жағдайда сәйкес жүргізіледі белгілі механизмі, бір сайт хромосомада встраивается бір ғана көшірмесі емес, жүреді қайта топтаудың кірістірілген материал. Тағы бір олардың қадір-қасиетін — жеңілдігі жеткізу әртүрлі даму сатысында. Предимплантационный эмбрион мүмкін өңделді немесе концентрацияланған вирустық штоками жолымен немесе бірлескен өсіру » монослоях жасушалы сызықпен, ол продуцирует ретровирус. Қолдануға болады постимплантационный эмбрион. Соңғы жағдайда ретровирусы өте ыңғайлы, бірақ жасуша зародышевых желілерін инфицируются төмен жиілігі, сондықтан тиімділік алу трансгенного жануарлар төмендейді. Жетіспеушілігі ретровирусных векторлардың шектеу мөлшері ДНК, оны ауыстыруға болады, олардың көмегімен. Тек фрагменттері аспайды, шамамен 10 000 жұп негізделген, тасымалдауға да геном жолмен.
Ретровирусы тамаша жақындайды ретінде пайдалану үшін векторлардың көшіру үшін генетикалық материалдың геном қатар ағзаның, гендік инженерлер өзгертуге ниеттеніп отыр: ретровирусы тұрақты встраиваются » геном және енгізеді, оған бөгде ДНҚ. Сонымен қатар, тағы бір керемет сапасы: лақтырып вирустық гендер (gag, pol, env) және олардың орнына екі LTR сұғындыр-деп генному инженерге қажет, және сақтауға бұл ретте әлеуеті встраивания және ауыстыру үшін жат ретровируса ақпарат геном иесінің.
Қалай жүзеге асырылады бағытталған өзгерту гендердің? Дегенмен жасушалары, жануарлар мен қабілетті встраивать инородную ДНК механизмі бойынша гомологичной рекомбинации, әлдеқайда жиі ендірілген жолымен жүргізіледі кездейсоқ рекомбинации арасындағы түпкі учаскелерімен сызықтық инородной ДНК және геномом. Жиілігі гомологичной рекомбинации өте төмен, осыған байланысты локуса мүмкін — 10 -3 — 10 -7. Шамамен 100 — 1000 кездейсоқ встраиваний жүреді бір гомологичное, меніңше, бұл — одан да сирек кездесетін оқиға. Бағытталған ендірілген негізделеді жиілігінің гомологичной рекомбинации, селекция сол сирек рекомбинантов, бұл есебінен құралады гомологичной рекомбинации.

Жалпы, селекцияға жасушалар, табысты трансформируемых енгізу жолымен инородной генетикалық ақпарат, әдетте, жүзеге асырады: қажетті құрылымын енгізеді, торлы бірге геном-маркермен, ол оңай ол тап жасуша ішіне, ол өзгереді. Түсуін гена-маркер дәлелдейді, ең алдымен, онымен бірге проникнул және қажетті ген. Екі нұсқа болуы мүмкін пайдалану маркер.
Бірінші олардың, идеологиялық және әдістемелік жағынан неғұрлым қарапайым пайдаланады аталатын өлшемді доминантную селекциялау. Бұл қағида бұрыннан және кеңінен қолданылады. «Плазмиде pBR322 бар екі геннің антибиотиктерге төзімділігі. Егер плазмида енеді бактериальную тор, ол сезімтал осы антибиотиктерге, онда ол тұрақты оларға арқасында гендердің экспрессиясын тұрақтылығын қамтылған плазмиде. Бұл доминантная селекция жағдайда бактериялық жасушалар. Дәл осындай селекцияға пайдалануға болады және эукариоттық жасушалар, және біз пайдаланды, оның қашан енгізді тор рекомбинантты ретровирусы бар ген төзімділігі неомицину. Жасушалар, олар тап рекомбинантты ретровирус, ойынының тұрақты осы антибиотику және алар өсуі бар оны ортаға. Жасушалар, олар емес, өз геном ретровирус, қалған нежизнеспособными осы ортаға және өмірден кетіп жатты.
Басқа жағдайда селекциясы үшін пайдаланады мутантные соматикалық жасушалары. Таңдайды жолдарының бірі метаболизм, біршама өнім, оның жасушалары өледі, мүмкін синтезироваться екі жолдары: алдындағы мүшенің Ал ішінара сақталған уақыт. С. Алады мутацию, ол мүмкіндік береді өнім құрылуы бірі-А. Таңдауда ингибиторы, арттыруды тежейтін айналдыру алдындағы мүшенің. өнім В. Мұндай мутантные жасушалары алмайды өсетін ортада тежегішімен. Алайда, егер оларды өзгерте және енгізу, оларда ген, ол еңсеріп мутацию мүмкіндік береді өнім пайда болса, ортаға тежегішімен болады қайтадан өтуге өсуі жасуша. Сонымен қатар жасушалары, трансформируемые құрылымдармен, құрамында ген, преодолевший мутациялар болады айыруға жылғы нетрансформируемых, дәлірек айтқанда, жай ғана ажыратуға болады, ал іріктеуге, селекционировать. Егер ген, перебарывает мутацию енгізілсін векторы сонымен қатар, геном, сіз embed жасушалар, онда олар түспеуі жасушаның бірге. Іріктеп жасушалар, өсуге қабілетті ортада тежегішімен, сіз үміттенеміз, өйткені бұл клеткалар қамтиды және сізге қажетті ген. Өте жиі құру үшін жарамды мутант пайдаланады метаболикалық жолдары нуклеотидтердің синтезі. Олар жақсы зерттелген және жүзеге асыруға мүмкіндік береді принципі селекция мутантты соматикалық жасушалар.
Алайда, деңгейінде тұтас организм жануарлар проблема анықтау монтировался ли қажетті ген » геном және экспрессируется ол айтарлықтай күрделене түседі. Мәселені шешуге болады еді шешу әлдеқайда оңай, егер сәтті жүргізуге селекцияға емес деңгейде қазірдің өзінде алынған жануарлар, ал деңгейінде эмбриондық жасушалар. Бұл жағдайда ма еді, бірақ пайдалануға бай арсенал селекция әдістерін, жинақталған генетикамен соматикалық жасушалар. Генетика-жануарлар, эмбриология, молекулалық және клеткалық биология құрдық мұндай мүмкіндік бар.
Нұсқалардың бірі пайдалану селекция-бұл деңгейлері қамтамасыз етеді эмбриональные ствольные жасушалары (ЭСК). Бұл жаңа технология революционизировала трансгеноз. Жалпы сызбасы ЭСК мұндай: ішкі клеточную массасын келген 4-5 күндізгі предимплантационной бластоцистер дәрежесінде мұздатылады орналастырады монослой жасушаларының жеткізетін матрикс бекіту үшін және өсу факторлары (бұл деп аталатын фидерлік, қоректік торлар). Өсу факторларын қолдайды плюрипотентный сипаты ствольных жасушалар, ингибируя салыстыру. Мұндай жағдайларда жасушаның ішкі жасуша массасындағы пролиферируют және белгілі бір уақыттан кейін оларды алып тастайды микропипеткой. Алынған жасушаларды диспергируют егеді жаңа фидерный қабаты. Өскен колония зерттейді микроскоппен және іріктейді ғана олардың морфологиясы тән ЭСК. Колония талаптарына жауап беретін, ресуспендируют егеді арналған фидерный қабаты. Нәтижесінде алады колония ЭСК сақтайтын плюрипотентность және беруге қабілетті химерных жануарлар. Мысалы, алу үшін химерную тышқан, эмбриональные жасушалары қаңтардағы қара гомозиготной тышқандар енгізеді у бластоцисту ақ тышқандар, гомозиготной бойынша аллелю albino. Егер подсадить бұл бластоцисту ложнобеременной тінтуірдің мүмкіндік оған туудың, онда ұрпақ химерными, яғни қамтуы ретінде жасушалар — ұрпақтары қара гомозиготы, сондай-ақ жасушалар — ұрпақтары ақ гомозиготы. Тері бұл тышқандар болады пятнистой. Бұл дақ белгісі болып табылады химеризма.
Скрестим алынған химер с гомозиготными альбиносами. Арасында ұрпақтар аламыз қандай қара тышқандар. Бұл қара тышқандар шығып, нәтижесінде бұл бөлігі подсаженных * региональды бағаналы жасуша қаңтардағы қара тышқандар енгізді ақпаратты ұсталады, олардың жасушалары зародышевого жол ашады. Бұл өте маңызды нәтижесі, көрсететін, бұл жолы құру үшін қолдануға болады трансгендік жануарлар.
Енді пайдалануға болады ЭСК үшін енгізілсін олардың инородную ДНК. Бұл әр түрлі тәсілдермен, мысалы, електропорацией арқылы немесе ретровирусов. Әдетте бірінші тәсіл. Содан кейін болады селекционировать сол жасушалары және тұрақты қолдайды инородную ДНК. Отобрав қажетті жасушаларды in vitro, олардың енгізеді тышқан дәл бұл описывалось жоғары. Трансдуцированные жасуша клоны сақтайды плюрипотентный сипаты.
Нәтижесінде, орнына іріктеп алуға трансгендік жануарларды жүзеге асырылады селекция ствольных жасушалардың пайдалана отырып, дамыған әдістері генетика соматикалық жасушалар.
Өте маңызды жету үшін сол мақсатқа сәйкес құрылады трансгендік жануарлар, проблема болып табылады воспроизведенной және тканеспецифической экспрессиясын бөгде гендерді. Экспрессия эукариотического гена көптеген факторларға байланысты. «Экспрессиясын реттеу қатысады деп аталатын цис-әрекеттегі элементтері — энхансеры (күшейткіштер экспрессиясын) және промоторы. Мата жүргізілетін экспрессия, жиі анықталады комбинациясы тканеспецифичного энхансера белгілі бір промотором. Көбінесе құру қажет мұндай шарттар үшін ген қалыпты шарттарда экспрессировался, ал включался ғана керек экспериментатору. Осындай индуцируемую экспрессию қамтамасыз етуге болады пайдалану есебінен промоторов, индуцируются. Мысалы, бар низкомолекулярные, бай ауру жағдайлары внутриклеточные белоктар металотионеины. Олар байланыстырады ауыр металлдардың иондары және ағзаны қорғап, олардың қолданылу. Гендердің экспрессиясы, кодирующих металотионеины, индуцируется қатысуымен ауыр металдар. Промоторы осы ген дердің жиі пайдаланады үшін тудыруы экспрессию трансгена дер кезінде. Бірқатар жағдайларда көрсетілді, бұл экспрессия бөгде гендерді трансгенном жануар мүмкін стимулируемой, егер азыққа қосуға ауыр металдардың тұздары. Промоторы гендердің тиіс гормондық реттелуі, сондай-ақ пайдалануға болады ұқсас мақсаты. Мысал LTR мышиного вирустың сүт безі ісігі. Нәтижелері көрсеткендей — дженифик болады модулировать in vivo сыртқы сигналдармен ғана өкінішті, бұл ынталандыру бар уытты әсерлерін төмендетеді, олардың құндылығы.
Сонымен қатар энхансерыы және промоторы — бұл барлық емес, бұл іске қосу үшін транскрипция. Бұл туралы бізге айтады тәжірибелер негізінде трансгендік жануарлар. Кезде гендер встраиваются » геном кездейсоқ, басым көпшілік жағдайда, олар экспрессируются ретінде тұрған еді күтуге құрылымын ескере отырып, және белгілі функцияларды реттеуші элементтерді оларға присоединяют жолығуыңыз қажет экспрессию да қалаған тіндерінде және қалаулы. Бұл білдіреді, бұл экспрессию гендердің әсер етеді ғана емес, қосылған реттегіш құрылымдар, бірақ және басқа да реттеуші элементтері, олар хромосомада иесінің орналасқан жанында қондырылған мәлімдеме жасады. Сондай-ақ, болуы мүмкін емес үшін маңызы экспрессиясын және жай-күйін хроматиннің жерде, қайда тап ген.
Гендік инженерия және трансгеноз атап айтқанда — сверхсложные ғылым саласы қазірдің өзінде көп нәрсеге қол жеткіздік, бірақ олардың даму көкжиегі шексіз. Олар мүмкіндік береді сұға қасиетті негіздері біздің өмір түсіну үшін, ең болмағанда ішінара) механикке өмір сүру молекулалық деңгейде.
2. ӘДІСНАМАСЫ АЛУ ТРАНСГЕНДІ ТЫШҚАНДАР
Кіріспе чужеродной ДНК мышам түрлі әдістермен жүзеге асыруға болады: 1) көмегімен ретровирусных векторлар, инфицирующих жасушалар эмбрион дамуының ерте сатысында алдында имплантацией эмбрионды самку реципиент; 2) микроинъекцией » үлкейтілген ядро спермия (аталық пронуклеус) ұрықтандырылған аналық жасуша; 3) енгізе отырып, генетикалық түрлендірілген * региональды бағаналы жасушаларды предимплантированный эмбрион дамуының ерте сатысында.
2.1 Пайдалану ретровирусных векторлар
Неғұрлым қарапайым тәсілмен жеткізу бөтен гендер геном жануарлар реципиент пайдалану болып табылады векторлар негізінде вирустар. Бұл жағдайда эмбриондар ерте (восьмиклеточной) даму сатысындағы инкубациялайды культуральной ортаға қатысуымен фибробластов, түзілетін рекомбинантты ретровирусы, және жұқтырғаннан кейін осындай вирустармен эмбриондар пересаживают псевдобеременным самкам тышқандар, олар өз дамуын жалғастыруда. Сонымен қарапайымдылық артықшылықтарының бірі осы тәсілді енгізу ДНК болып табылады геном жасуша ұрық ықпалдасады, әдетте, бір көшірмесі-зерттелетін геннің, фланкированного ұзын соңғы повторами вирустық хромосоманың, бұл ықпал етуі мүмкін тиімді геннің экспрессиясы. Алайда кемшіліктерге әдісін жатқызуға болады жүргізудің қажеттілігі қосымша гендік-инженерлік манипуляцияларды дайындау кезінде ретровирусного вектордың шектеулі сыйымдылығы векторының (мөлшері кірістіру — дан 10 т. п. о.), соның салдарынан трансген болуы мүмкін айырылған іргелес реттеуші тізбектер үшін қажетті, оның экспрессиясын, мозаицизм түзілетін трансгендік жануарларды тұрады, жасушаларының ретінде бар, сондай-ақ құрамында жоқ трансгены.

У сүтқоректілердің кейін ену ұрығы біріктіру яйцеклетку ядро спермия (аталық пронуклеус) және ядросы аналық клеткалар бар бөлек-бөлек. Кейін соңғы аяқтап, митотическое бөлу айналады әйелдер пронуклеусом, орын алуы мүмкін ядролардың бірігуі (кариогамия). Аталық пронуклеус, әдетте, әлдеқайда көп әйелдер, оңай, оны ауыздықтау арқылы секциялық микроскоптың енгізіп, оған чужеродную ДНК. Бұл ретте яйцеклетку өткізу кезінде микроинъекции ауыстыруға болады бағыттау қажетті түрде жазып алуы. Тәжірибелі зерттеуші үшін мүмкін инокулиронать бірнеше жүз жұмыртқа.
Енгізгеннен кейін ДНК 25-тен 40 жұмыртқа имплантируют микрохирургическим жолымен «суррогатную» ана, тудырады жалған жүктілік скрещиванием с вазэктомированным самцом. У тышқандар спаривание — бұл бірден-бір танымал тәсілі-жатырдың имплантациялау. Өйткені вазэктомированный аталық сперматозоидтар емес продуцирует, бірде-біреуі жұмыртқа «суррогат» ана оплодотворяется. Эмбриондар дамып ғана пайдалануға берілген жұмыртқа, және мышата туады кейін шамамен 3 апта кейін имплантациялау.
Сәйкестендіру үшін трансгенді жануарларды бөледі ДНК-ның кішкентай кусочка құйрығының және тестілейді, оның болуы трансгена көмегімен блот-будандастыруды бойынша Саузерну полимераздық тізбектік реакция әдісімен (ПТР). Анықтау үшін, ма трансген жасушаларында зародышевой желісі жануарлар, трансгенную тышқан скрещивают басқа тінтуір. Бұдан әрі жүргізуге болады теңдеулер ұрпақтарын алу үшін таза (гомозиготных) трансгенді желілер.
Сипатталған көзқарас, меніңше, бірінші көзқарас салыстырмалы түрде қарапайым, бірақ ол талап етеді нақты үйлестіру әр түрлі кезеңдері. Тіпті высококвалифицированному маманға қолынан алуға өміршең трансгендік жануарларды жақсы жағдайда, тек 5% инокулированных жұмыртқа. Бірде-бір кезеңі эксперимент емес, тиімді болып табылады 100%, сондықтан микроинъекций пайдалану қажет үлкен саны оплодотворенных жұмыртқа. Мысалы, кезде трансгендік тышқандар инъекциядан кейін ДНК тірі қалады, тек 66% оплодотворенных жұмыртқа; мышата дамиды шамамен 25% имплантированных жұмыртқа, әрі трансгенными оның ішінде көрсетіледі тек 25%. Осылайша, 1000 имплантированных оплодотворенных жұмыртқа дамиды 30-дан 50 трансгенді мышат. Сонымен қатар, енгізілген ДНК мүмкін біріктіруге кез келген орын геноме, және көбінесе көптеген оның көшірмелерін қосылады бір сайт. Және ақырында, барлық трансгендік мышата ие болады қажетті қасиеттері бар. Организмде кейбір дарақ трансген мүмкін емес экспрессироваться-неподходящего ортасынан сайта интеграция, ағзадағы басқа да саны көшірмелерін чужеродного гена болуы мүмкін тым үлкен, бұл әкелуі мүмкін гиперпродукции ақуыз және бұзу қалыпты физиологиялық процестер. Дегенмен, барлық қарамастан, бұл әдіс микроинъекций пайдаланады алу үшін желілерінің тышқандар, көтергіш функционалдық трансгены, өте жиі.
2.3 Пайдалану түрлендірілген * региональды бағаналы жасуша
Клеткалар бөлінген мышиных эмбриондарды сатысында бластоцистер дәрежесінде мұздатылады, мүмкін пролиферировать мәдениет сақтай отырып, қабілеті дифференцировке кез келген жасуша түрлерін, оның ішінде және жасушаның зародышевой желісі, енгізу кезінде басқа эмбрион сатысында бластоцистер дәрежесінде мұздатылады. Мұндай жасушалар деп аталады плюрипотентными эмбриональными жасушалары (ЕЅ). ЕЅ клеткалары мәдениет оңай өзгертуге гендік инженерия әдістерімен бұзбай плюрипотентности. Мысалы, белгілі бір сайт несущественного гена олардың геноме болады встроить функционалдық трансген. Содан кейін не іріктеуге өзгертілген жасушалары, дәріптеу, оларды пайдалану үшін трансгендік жануарларды алу. Бұл болдырмауға мүмкіндік береді кездейсоқ встраивания тән әдісін микроинъекций және ретровирусных векторлық жүйелер.
Рекомбинантты гендер енгізеді, мұндай жасушалар кез-келген жоғарыда аталған тәсілдерінің, сонымен қатар, электропорацией немесе басқа стандартты әдістерімен, қолданылатын жеткізу үшін гендер адам өсіретін, соматикалық жасушалар. Сонымен бірге зерттеліп отырған генами енгізілуі мүмкін селектируемых маркерлер, олар мүмкіндік береді іріктеу жасушалар, экспрессирующих деректер маркерлер және, демек, кепілді бар тіркеме тіркелген, олармен зерттелетін гендер. Іріктелген осылайша жасушалары ауыстырады да бластоцистер дәрежесінде мұздатылады дамушы эмбриондарды пайдаланады немесе алу үшін агрегационных химер бірлестігі олардың жасушалары восьмиклеточных эмбриондарды кейіннен басшыларымен эмбриондарды псевдобеременным самкам.
Кезінде трансфекиии ЕЅ-жасушаларының мәдениеті векторы арналған интеграция өзіне тән хромосомдық сайты, кейбір жасушаларда ДНК встраивается кездейсоқ, басқа ендірілген жүреді нужный сайт, көптеген сол ЕЅ-жасушалардың интеграцияның мүлде болмайды. Санын арттыру үшін жасуша бірінші типті пайдаланады аталатын өлшемді жағымды-жағымсыз селекцияға. Бұл стратегия тұрады позитивті жасуша селекция, көтергіш векторлық ДНК, встроившуюся керекті сайт, және теріс селекция жасушаларының бастап векторлық ДНК, интегрировавшей кездейсоқ сайт.
Сайт-нысана болуы тиіс мұндай облысының геномдық ДНҚ, кодирует маңызды белоктар үшін интеграция чужеродной ДНК әсер етпесе, даму үдерісі немесе жасуша функциясы. Сонымен қатар, айтарлықтай үшін ендірілген трансгена емес блокировало те тиісті учаскесінің геномның. Іздеу ұқсас сайттар үздіксіз жүргізіледі.
3. ПАЙДАЛАНУ ТРАНСГЕНДІ ТЫШҚАНДАР
Трансгендік тышқандар бола алады модельдік жүйелерді зерттеу үшін аурулар адам үшін тест-жүйелермен зерттеу мүмкіндіктері синтез өнімдерін, үшін қызығушылық туғызатын медицина. Пайдалана отырып, бүтін жануарлар, модельдеуге және патология пайда болуы және оның дамуы. Алайда, тышқан — адам емес, дегенмен ол да сүтқоректілер класына жатады, сондықтан деректер алынған трансгенді үлгілерде әрқашан болады экстраполировать адамға қатысты медициналық аспектілері. Дегенмен, кейбір жағдайларда олар мүмкіндік береді анықтау points этиологиясы күрделі ауру. Назарға ала отырып, бұл ғалымдар: «мышиные» моделін мұндай генетикалық аурулар, Альцгеймер ауруы, артрит, бұлшық ет дистрофиясы, білім беру, ісіктер, гипертония, нейродегенеративные бұзылу, дисфункция эндокриндік жүйе, жүрек-қан тамырлары аурулары, және көптеген басқалар.
Біз көп қазірдің өзінде бұл туралы мутациялар әкеледі обыры, аномалиям дамытуға, мұрагерлік аурулар және тозуға. Мутациялар, сондай-ақ негізіне эволюция. Бұл өте маңызды болар еді қадағалауға қалай пайда болады мутациялар деңгейінде тұтас ағза. Пайда болғанға дейін трансгеноза жасағандай, көп жағдайда деңгейінде жасушалық дақылдар.
Мүмкіндігі қарапайым талдау мутацияларды деңгейінде тұтас ағзаның тартымды деп еді қалай көруге мутациялар пайда болады, әртүрлі органдар мен тіндерде.
Пайдалану трансгенді тышқандар мүмкіндік берді прослеживать үшін зақымданған ДНК, репарацией осы зақымданулардың пайда болуына байланысты мутациялар және қатерлі ісік бір организмде. Басқаша көруге барлық тізбекті — зақымдалған ДНҚ, мысалы, химиялық агенттер дейін физиологиялық көріністері салдарын осы зақымдар.
ҚОРЫТЫНДЫ
Биотехнологияны деп атауға болады ең сәнді сала соңғы онжылдықта. Оның айналымы өсуде завидными қарқынмен, бірақ әлдеқайда тез өседі күту көрсетіледі инвестициялар көлемдері мен саны жаңадан пайда болатын биотехнологиялық фирмалар. Сол уақытта осы саладағы жетістіктері, деп көзіне айналады қоғамдық қорқыныш, крекингтің және наразылық. Бәлкім, тарихында индустриялық қоғамның ґтсе де басқа саланың вызывавшей өзіне осындай полярное қатынасы.
Генетикалық модификациясы, жануарлар технологиясының көмегімен рекомбинантты ДНҚ (трансгеноза) негізделген енгізу клонированного гена(лар) геном жасуша алатын дать начало жасушаларына зародышевой желісі. Скрещивая трансгенді ұрпақ нәтижесінде пайда болған осындай операцияға алуға болады гомозиготные желісі трансгендік жануарлар. Көптеген зерттеулер осы саладағы жүргізілген арналған мышах. Әдетте, бұл үшін жасайтын клонированный ген » оплодотворенную яйцеклетку тышқан көмегімен микроинъекции, сайлауын баә-дегі оны реципиентную самку және тексеріп ұрпақ болуын енгізілген гена. Чужеродный ген болады енгізуге оплодотворенную яйцеклетку тінтуірдің көмегімен ретровирусного вектор. Баламалы тәсіл бөлу мышиных * региональды бағаналы жасуша және трансфекции олардың клонированным мәлімдеме жасады. Бұл ретте енгізілетін конструкциясы болуы тиіс интеграциялануға геном дің жасушалары. Жасушалар, тірек ген нысана-белгілі бір хромосомном сайтында, іріктейді және насихаттайды, содан кейін енгізеді, оларды мышиные эмбриондар дамуының ерте сатысында. Мышиные эмбриональные діңгек жасушалары плюрипотентны, т. е. мүмкін дать начало жасушаларына кез келген түрін, соның ішінде жасушаларына зародышевой желісі. Осылайша алынған тышқандар, синтезирующие ғана адам антиденелер. Оларды пайдаланды модельдік жүйелер ретінде зерттеу үшін генетикалық аурулар. Гендердің модификациясы бар тышқандар заполонила барлық саласындағы биомедициналық ғылым. Әсері бұл тәсіл түсіну функциялары гендердің және приносимая атындағы пайдасы адамзатқа өсетін болады және өседі.
ПАЙДАЛАНҒАН ӘДЕБИЕТТЕР ТІЗІМІ
1.Баурин в. В., Мирошниченко в. м., Захарченко В. И. және т. б. / / Генноинженерные ауыл шаруашылығы жануарлары, Мәскеу, 2005, с. 154-165.
2.Бондарук в. В. Захарченко В. И., Беляева Р. Х. және т. б. / / Генноинженерные ауыл шаруашылығы жануарлары, Мәскеу, 2005, с. 138-153.

Добавить комментарий

Your email address will not be published.