Лимфоциттерден секреторлық түйіршіктерді оқшаулау

Соңғы хабарлама [1,2] деп баса айтты апоптоздың рөлі, аутоиммунитета және Т-лимфоциттер, ықтимал маңызды факторының патогенезінде созылмалы бітелген өкпе аурулары, және, атап айтқанда, Т-жанама иммундық жауап кезінде демікпе.
Лимфоциттер болып табылады негізгі буыны иммундық жүйесін және қатысатын барлық иммундық және аутоиммундық реакциялар, өте маңызды, олардың рөлі аллергиялық реакциялар кезінде [3]. Әдетте, зерттеуде және бағалауда, иммундық организмнің жай-күйін, сондай-ақ зерттеуде молекулалық механизмдерін, олар бойынша ағады көптеген аурудың басты объектісі зерттеу болып табылады лимфоциттер.
Сондықтан өте маңызды кезеңі-мұндай зерттеулерді жүргізу алу болып табылады таза және тіршілікке қабілетті таралымдарын лимфоциттер.
Тарау I. әдебиет Шолу
1.1 Лимфоциттер
Лимфоциттер — жасушалар иммундық жүйесін білдіретін түрі лейкоциттер топтар агранулоцитов, ақ қан клеткаларының. Лимфоциттер — негізгі жасушалар иммундық жүйе қамтамасыз етеді гуморальды иммунитет (әзірлеу антиденелер), жасушалық иммунитет (байланыс өзара іс-қимыл жасушалары-құрбандары), сондай-ақ қызметін реттейді жасушалардың басқа түрлері. Қан ересек адамның қалыпты жағдайда ұсталады 20-35 % лимфоциттер (1000-3000 кл/мкл). Сол уақытта қан құрамында тек шамамен 2 % лимфоциттер орналасқан организмде, қалған 98% — ы орналасқан ұлпа. Лимфоциттер ие бірегей қасиеті — қабілеті тануға, антигендер. Лимфоциттер түзіледі лимфа түйіндерінде, көмекей безі, кейде червеобразном отростке, көк бауырда, вилочковой безінде (тимусе) және сүйек кемігін. Көпшілігі покоящихся лимфоциттер білдіреді кіші лимфоциттер — шағын жасушалар ядросы күңгірт, бұған суға айналдыра отырып хроматиннің және салыстырмалы саны аз цитоплазмы қамтитын жекеленген митохондрии. Морфологиялық белгілері бойынша бөлінеді екі типтегі лимфоциттердің: үлкен гранулярные лимфоциттер (көбінесе олар NK-жасушалары, немесе едәуір сирек, бұл белсенді жасушалар лимфоидного бірқатар — лимфобласты және иммунобласты) және кіші лимфоциттер (T және B жасушалар) [4].
Функционалдық белгілер бойынша ажыратады үш түрін лимфоциттер: B-жасушалар, Т-жасушалары, NK-жасушалары.
·В-лимфоциттер распознают бөгде құрылымын (антигендер) вырабатывая бұл ретте ерекше антиденелер (белок молекулалары қарсы бағытталған бөтен текті құрылымдар).
секреторлы түйіршіктер иммундық лимфоцит
·Т-лимфоциттер функциясын орындайды реттеу иммунитет. Т-көмекшілері ынталандырады токсиндерді антиденелер, ал Т-супрессоры тежейді.
·NK-лимфоциттер бақылауды жүзеге асырады сапасын жасушалардың ағза. Бұл ретте, NK-лимфоциттер қабілетті бұза жасушалар, олар өздерінің қасиеттері бойынша ерекшеленеді қалыпты жасушалар, мысалы, қатерлі ісік жасушалары. Мазмұны Т-лимфоциттер, қан құрайды 65-80 % жалпы санынан лимфоциттер, В-лимфоциттер — 8-20 %, NK-лимфоциттердің — 5-20 %. Білім антиденелердің орталық рөл атқарады B-лимфоцитам. Бұл ретте, B-лимфоциттер қамтамасыз етеді өзіне тән жүре пайда болған иммунитет бірге басқа да шағын лимфоцитами — T-лимфоцитами пайдалана отырып, әр түрлі механизмдер бағытталған көп жағдайда кеңейту шегінен тиімділігін иммунитеттің туа біткен мерезден.
Лимфоциттер-сынып оқушысы T құрылады зобной безінде, немесе тимусе, олар қайдан алды өзінің таңбасы — «T»: ізашарлар T-лимфоциттердің түседі, тимус, және жүреді, олардың пісіп-жетілуі. T-лимфоциттер болып бөлінеді бірқатар сілемейлі. Басты шаралар, бұл-екі түрлі, неперекрывающиеся субпопуляции: жасушалары бір көтереді маркер CD4 және негізінен «көмектеседі» жүзеге асыру, иммундық жауаптың немесе индуцируют (T-хелперы), жасушаның басқа көтереді маркер CD8 ие көбінесе цитоуытты белсенділігі (цитотоксикалық T-лимфоциттер (T-киллеры).
.2 Дезоксирибонуклеазы секреторных түйіршіктер лимфоциттер перифериялық қан пациенттердің АБА
Зерттеу нуклеазного құрамы түйіршіктер лимфоциттер байланысты рөлін осы нуклеаз аурулардың дамуында сипатталатын заң бұзушылықтарға иммунном деп жауап берген. Иммундық жүйе шабады аутологические мата келтіріп, терең өзгерістер. Бұл жағдайда мата инфильтрируются Т-лимфоцитами, кейбір олардың цитоуытты белсенділігі (цитотоксикалық Т-лимфоциттер; ОКЗ) әкеледі Т-опосредованному аутоиммунному ауруы.
Лимфоцит-қосымша түрде цитолиз байланыстырады жұмысына ерекше нуклеазной белсенділігі цитотоксических жасушалардың [7]. Бұл қышқыл ДНКаза, молекулалық салмағы 66 сжк іске қосылады иондарымен Ca2+ және ингибируется Zn2+, специфична ДНҚ. Науқастарда шашыранды склерозом бұл нуклеазная белсенділігі артып келеді сезімтал — оксиду азот, бірақ жоғалтады сезімталдығы иондарына мырыш.
Кейбір сәттер дамыту кезінде бронх орган-ерекше аутоиммундық аурулар (мысалы, инфильтрация лимфоциттер ошағында ауру) подвели бізді іздеуге, зерттеуге нуклеазной белсенділігін секреторных түйіршіктер лимфоциттер қан пациенттердің АБА.
.3 Әдістері бөлу және зерттеу лимфоциттер
Градиенты тығыздығы бөлу үшін лимфоциттердің бірі тұтас перифериялық қан адам.
Фиколл 400 білдіреді гидрофильный полимер сахароза бар жоғары молекулалық салмағы. Молекулалық салмағы Фиколла құрайды 400000. Осмостық қысым оның ерітінділерді төмен ерітінділерді сахароза эквивалентті концентрациясы, пайдалануға мүмкіндік береді изотонические градиенты тығыздығын және сақтауға физиологиялық және морфологиялық қасиеттері, жасуша және органелл процесінде центрифугалау. Фиколл 400 кеңінен қолданылады күнделікті жұмыста бөле отырып, қан жасушаларының және бөлу үшін жасушалар мен органелл тұндыру, ауырлық күшінің әсерімен. [5]
Фиколл-пак білдіреді дайын тұтынуға стерильді ерітінді тығыздығы 1,077 г/мл үшін пайдаланылатын бөлу лимфоциттер перифериялық қан арқылы адамның қарапайым және жылдам рәсім Фиколл-Пак білдіреді қоспасы Фиколла 400 (5.7 % салмақ/көлем) және диатризоата натрий (9,0 % салмақ/көлем). Фиколл-Пак үшін пайдаланылады бөлу лимфоциттерді анықтау кезінде тіндік үйлесімділігі мен цитотоксичности. Рәсім бөлу мүмкіндік береді жоғары шығу өміршең лимфоциттер бұзбай арасындағы ара Т — және В-жасушалары.
Перколл — бірегей сәрсенбі центрифугалау үшін » градиенте тығыздығын, арнайы арналған ұстап тұру үшін физиологиялық шарттар процесінде центрифугалау. Сәрсенбі білдіреді стерильді коллоидты ерітінді бөлшектердің кремний қос тотығы жағылған поливинилпирролидоном (КҰЕ). Перколл нетоксичен үшін жасуша және құра алады градиенты тығыздығы диапазонында дейін 1,3 мг/мл. Градиенты болады преформировать, не олар қалыптасады кенеттен кезінде центрифугалау. Перколл төмен осмоляльность (20 мосм/кг H2O), соның арқасында бойы градиенті нақты қолдау физиологиялық шарттар. Салдарынан үлкен көлемдегі бөлшектер центрифугалау ерітіндісін перколла кезінде бірқалыпты жылдамдықпен әкеледі қалыптастыру тығыздық градиенті. Сондықтан, бөлу, әдетте, өте тез жүреді. Сәрсенбі, үшін пайдаланылатын центрифугалау, мүмкін изотоничной бүкіл көлемі кіруінің арқасында оған тұздардың немесе сахароза. Соқпайды құру жайпақ градиенті, бұл мүмкіндік өте тиімді бөлу мембраналық фракциялары бойынша олардың өздігінен көтерілетін жүзбелі тығыздығы.
Қасиеттері перколла:
.Диапазоны тығыздығы үшін жарамды равновесного центрифугалау жасушаларының, вирустар және субклеточных бөлшектердің константой десиментации > 70S.
2.Белгіленеді физиологиялық ионную күші мен рн.
.Төмен тұтқырлығы.
.Емес енеді арқылы биологиялық мембраналар.
.Мүмкін стерилизован бірнеше рет.
.Үйлесімді биологиялық материалдармен.
.Оңай бөліп жылғы тазартылған материал.
.Жоқ елеулі әсерін өшіру кезінде тіркеу радиоактивтілік. [5]
Ультрацентрифуга
Ультрацентрифуги — ең узкоспециализированный түрі аспаптарды, қызметші, негізінен, үшін ғылыми-зерттеу міндеттерді седиментациялау агрегаттарының вирустарды бөлу, жасушаға дейінгі структуралардың, белоктар және басқа жоғары молекулалы қосылыстар, нуклеин қышқылдарының және, тұтастай алғанда, бөлу бөлшектердің өлшемі 100 нм кем. Жұмыс істеу принципі ультрацентрифуги ұқсас басқа зертханалық центрифугам, бірақ техникалық параметрлері бойынша олар едәуір өнімдірек барлық зертханалық модельдер. Олар қабілетті жетуі жылдамдығы 150 000 об/мин және жеделдету астам 1 000 000g. Сонымен бұрыштық және бакетных роторлар, центрифугалар жүйесімен жабдықталуы мүмкін проточными немесе аймақтық роторлармен үлкен бір ішкі қуысына үшін бөлінген сұйықтық. Орындау бойынша ультрацентрифуги болуы мүмкін үстел, сондай-ақ напольными. Жүргізіледі аспаптар осы сынып компаниялармен Beckman Coulter және Thermo Scientific.
Біз пайдаландық ультрацентрифугу компанияның Beckman Coulter OptimaTM L-series.
Еден ультрацентрифуги сериясы Optima L қабілетті жұмыс жылдамдығы 100 000 об/мин (L-100K) үдеуімен дейін 694000×g/802000×g (кесте.1). Центрифугалар жинақталады зор жанында бұрыштық және көлденең ротор жабдықталған сенімді вакуумированным индукционным жетегін, басқару және бақылау жүйесі базасында микропроцессордың және қоршаған орта үшін қауіпсіз суыту жүйесі, пайдаланылмайды фторированные көмірсутектер немесе басқа да сұйық хладагенты, кіріктірме жүйесімен түзету теңгерімсіздік ротордың 10% — ға дейін. Серия Optima L толық белгіленген талаптарға сәйкес келмеуі кезінде жұмысты биологиялық қауіпті материалдар бар тиісті сертификаттар биоқауіпсіздік бірнеше деңгейде. Центрифугалар қосылады желісіне 220В, орналастыруға мүмкіндік береді, олардың кез-келген ыңғайлы жерде. [6]

1-кесте. Техникалық сипаттамалары ультрацентрифуг сериясы Optima L
Диапазоны скоростейOptima L-90K: 1 000 — 90 000 об/мин, қадаммен 100 об/мин Optima L-100K: 1 000 — 100 000 об/мин, 100 қадам туралы/минКонтроль жылдамдығы± 20 об/минМаксимальное ускорениеOptima L-90K: 694000×g Optima L-100K: 802 000 × дВместимость1 500 млОбъем үлгідегі бір ячейкеот 230 мкл-ден 250-ге дейін млРежимы жұмысын таймеру дейін 99 сағат 59 минут режиміне HOLD w2tУстановка температуры0°. +40°C, қадам 0.1°СКонтроль температурасын± 0,5°C белгіленген значенияКонтроль теңгерімсіздік±5 мл немесе 10% көлемінде кемінде 5 млТемпература қоршаған орта+15°. +40°ССистема охлажденияИспользуется экологиялық қауіпсіз хладогентПрофили жеделдету — быстрый: 0 айн/мин дейін берілген жылдамдық; баяу: 0-ден 500 об/мин, бұдан әрі тез жылдамдығы дейін белгіленген скоростиПрофили тежеу — динамикалық тежеу; баяу (500 айн/мин жылдам тежеу, бұдан әрі баяу тоқтауы; жоқ торможенияПрограммы9 бағдарламалар белгіленетін пайдаланушы мүмкіндігін кейінге қалдырылған стартаСистема азайту трениядаТепловыделение1 кВтУровень шумаменее 57 дБВнешние габаритыВ: 1207 × Г-да: 673 × Ш: 940 ммВес465 кгТребования — электросети220-240,20, 50 Гц (бір фазалы ток)
Аймақтық-жылдамдықты центрифугалау
Қаңтардағы техникалық жағынан сауатты жүзеге асыру процесін ультрацентрифугирования байланысты табысты эксперимент, сондай-ақ, сақталуын және қызмет ету мерзімі қымбат машиналар. Сондықтан, талдап көрейікші, бұл әдісі болып табылады ультраценрифугирования.
Ерекшеліктері осы түріне центрифугировнаия көрсетілген атауында: «жылдамдық», өйткені бөлшектер бойынша бөлінеді тұну жылдамдығын, әрі тығыздығы, олардың әлдеқайда көп тығыздығы, ортаның және «аймақтық» өйткені бөлшектер әр түрлі мөлшерін реттеуге немесе одан кем шектеулі қабаттары — аймақтар. Бөлшектер әр түрлі мөлшерлерін белгілеудің тазартылады емес бөлек-бөлек, бір мезгілде, бір центрифугалау.
Бастапқы қоспа бөлшектердің келтіреді түрінде жұқа қабаты неғұрлым тығыз ортаға заполняющую барлық көлемі пробиркалар бакет-ротордың. Барысында центрфугирования неғұрлым ауыр бөлшектер тез жылжиды түбіне пробиркалар. Оларға артта қалып келеді, бірақ тым түрінде жеке қабатын, қозғалады кем ірі бөлшектер, кейін ұсақ және т. б. осылайша, құрылады дискретті аймақтың немесе жолақтар бөлшектердің бір біріне мүлдем ұқсамайтын тұну жылдамдығымен. [7]
Равновесное центрифугалау
Идея әдіс құру осындай градиенті ұзындығы бойынша пробиркалар (бакет-роторда орналасуы, тығыздығы, ортаның центрифугалау у түбін болды, неғұрлым тығыз бөлшектер, сондай-ақ мениска — аз, аз тығыз. Кезде жеткілікті ұзақ центрифугалау бөлшектер болады бойымен жылжыту градиенті кезге дейін қол жеткізілген жоқ, ережелер, онда ортаның тығыздығы-ке тең, олардың өздігінен көтерілетін жүзбелі тығыздығы. Қозғалысы тоқтатылады, бөлшектер әр түрлі тығыздығы орналасады түрлі учаскелерінде градиенті. Осылайша, жүзеге асырылады фракциялау бөлшектер, олардың тығыздығы.
Мұндай бөлу мынадай ерекшеліктері бар:

Ілмек акриламид және бис-акриламид ерітеді 100 мл дН2О.
Сипаттамасы көші-қон белоктар. Электрофоретическая қозғалғыштығы биополимеров суықтық (Rf’) пропорционалды олардың қозғалысы еркін сұйықтық (RfO) қатынасымен анықталады жиынтық заряд макромолекулы оның массасы. Фактор обуславливающим қарағанда Rf’ желтоқсандағы RfO болып табылады үйкеліс күші туралы гель. Үйкеліс күші байланысты арақатынасын сызықтық өлшемдері белоктар және жұж-гель, және, демек, молекулалық масса белоктар. Молекулалық массаны көптеген белоктар аспайды 500000, сондықтан пайдалану гельдерді агарозы мақсатқа сай емес. Әдетте, белоктар электрофорез жүргізеді ПААГ қамтитын 5% — дан 20 % акриламид.
Жоғарыда айтылғандай, белоктар цвиттер-иондарымен. Олардың жиынтық зарядпен, ал қатынасымен зарядтың массасына басқаруға болады өзгерту рН буфер, онда полимеризуется ПААГ және электрофорез жүргізіледі. Оңтайлы рН мәні жұмыс буфер негіздейді емес максималды заряд, ал максималды айырмашылық зарядтарының әр түрлі белоктар құрайтын қоспасы. Осылайша, рН жұмыс буфер тиіс тым ерекшеленуі изоэлектрических нүктелерінің барлық белоктардың қоспалары (изоэлектрической нүктесінде барлық белоктар бар бейтарап заряд). Үшін қышқыл белоктар оңтайлы мәндері рН — бейтарап немесе слабощелочное. Белоктар мигрируют жылғы катодты (-) аноду (+). Сілтілік ақуыз (гистонов, белоктар рибосом және т. б.) орынды пайдалану слабокислые буферлер (рН = 4 — 5). Бұл белоктар ерекшеленеді көлемі бойынша жиынтық оң заряд және мигрируют оңтүстік бағытында анодты (+) катоду (-). Әдетте жылдамдығы көші-қон байланысты үш параметрлерін талданатын белоктар: шамасы молекулалардың нысаны молекулалардың және жиынтық заряд.
Үшін бір мағынада анықтау молекулалық массасы ақуыз жылдамдығы бойынша оның көші-қон кезінде электрофорезе полипептидную тізбегін распрямляют (сур.1). Мұндай қабылдау кезінде пайдаланылады электрофорезе белоктар, өңделген додецилсульфатом натрий (ДСН — C12H25OSO3Na).
Сур. 1. Схемасы денатурации ақуыз
Бөлу ақуыз мөлшері бойынша пайдалана отырып, натрий додецилсульфата (ДСН). Әдістің мәні. Электрофорез » ПААГ-ДСН мүмкіндік береді фракционировать белоктар тек молекулалық массасы. Бұл үшін белоктар өңдейді үш мол ДСН-Na (1,4 мг ДСН-Na 1 мг белок). Әсерінен ДСН олигомерные ақуыз диссоциируют арналған субъединицы және денатурируют. Тұрақтылығы ара детергент/ақуызы ж / е тұрақты қарым-қатынас (-) заряд массасына кез-келген ақуыз. Арқасында электрлі отталкиванию қалдықтарынан күкірт қышқылын бетінің ақуыз полипептидная тізбек распрямляется алады және нысанын қатаң эллипсоида айналу (сур.2).
Сур. 2. Схемалық бейнесі полипептидтік тізбегінің кейін қосу ДСН
Мөлшері кіші осі эллипсоида тең 1,6 нм, үлкен — желілік байланысты саны аминоқышқыл қалдықтары, т. е., молекулалық салмағы.
Электрофоретическая қозғалғыштығы (Rf’) байланысты, молекулалық салмағы белок (М) ара қатынасы: Rf’ = A — B lg M, мұндағы А және В — коэффициенттері кеуектілігін гель және т. б. жағдайлар.
Шамасын электрофоретической қозғалысы (Rf) анықтайды салыстырмалы бірліктерде білдіретін қатынасы жолдарын көші-қон ақуыз — көші-қон бромфенолового көк кезінде электрофорез.
Бір мезгілде жүргізеді электрофорез ақуыз-«маркерлердің», молекулалық массасының оның белгілі. [9]
1.4 Қорытынды бойынша шолу әдебиет
Сонымен, көп жылғы зерттеулер көрсеткендей, ДНКазы білдіреді лабильную жүйесіне, — мұқтаждарына ілтипатпен реагирующую түрлі тікелей және жанама әсер ету.
ДНКазы маңызды ғана емес, процестерге нуклеинового алмасу, бірақ және қолдау үшін физиологиялық ДНК концентрациясы адам ағзасында. Мысалы, арттыру концентрациясы ДНК қан әкелуі мүмкін жинақтау ДНК-белокты кешендер, индукция жетілдіріп, анти-ДНК антиденелер және дамыту әр түрлі патологиялар. Дамыту аутоиммундық аурулардың, сондай-ақ байланыстырады өзгеруіне белсенділіктің нуклеаз иммунокомпетентных жасушалар.
Сәйкестендіру жаңа нуклеаз, оның ішінде апоптотических тиіс жол салуы үшін одан арғы зерттеулер ашу бойынша жаңа функциялар нуклеаз және жарықтандыруға жасырын арасындағы байланыс апоптотической тозуымен ДНК және аурулармен ауыратын адам. [10]
Осылайша, түсінікті біздің көңіл қасиеттерін зерттеу нуклеаз лимфоциттер бөлінген перифериялық қан науқас бронх демікпесімен.
.5 Мақсаттары мен міндеттері
Зерделеуге байланысты әдебиет, осы мәселе бойынша жұмыс мақсаты болды игеру әдісін бөлу секреторных түйіршіктерін Т-лимфоциттерді және олардың сипаттамасы белоктық құрамының электрофорез әдісімен.
Сәйкес мақсаты мынадай міндеттер:
.Игеру әдісі ультрацентрифугирования және жұмыс ультрацентрифуге Beckman Coulter OptimaTM L-series.
.Бөлу фракциясы Т-лимфоциттер низкоскоростным центрифугалау » градиенте тығыздығы фиколла.
3.Бөлу секреторные түйіршіктер Т-лимфоциттер әдісімен ультрацентрифугирования.
.Анықтау секреторных түйіршікті болуы ақуыз фракцияларын электрофорез әдісімен.
II тарау. Материалдар мен әдістері
Зерттеу объектісі. Зерттеу нысаны қызмет еткен, лимфоциттер, бөлінген перифериялық қан сау донорлардың. Қан (5 мл) арқылы жүзеге асырылды венопункции кубитальной венадан. Қан беріп, қалғанын өздері алатын » пробиркаға антикоагулянт Na2-гепарин. Қан өткізілді емханада жұқпалы-аллергиялық аурулар, Казанский ҒЗИ эпидемиология және микробиология кафедрасы.
Бөлу Т-лимфоциттер. Жиналған қан үлгілері көшпелілер физиологиялық ерітіндімен: 2 мл ФҚҚ + 3 мл қан. Абайлаңыз перемешивали және баяу наслаивали разведенную қан алынып, 5 мл тығыздық градиенті фиколла-400 (r=1.077 г/см). Центрифугировали ішінде 40 минут 3000 айн/мин бөлме температурасында (Eppendorf 5810 (R). Бөлу кезінде лимфоциттер құрайды плавающее сақина бетіндегі фиколла. Арналған жұмыстарды таңдап алды сақина лимфоциттер және қабылдай бастады таза пробиркалар. Лимфоциттер отмывали 5 мл физиологиялық ерітінді: центрифугировали кезінде 10 минут 2000 айн/мин (Eppendorf 5810R). Супернатант сливали, тұнба суспенизировали ерітіндісімен фосфатно-тұзды буфер (5 мл) және 10 мин центрифугировали кезінде 2000 об/мин (Eppendorf 5810 (R).
Алу сығындысы түйіршіктер бірі цитоплазмы лимфоциттер. лимфоциттер промывали 1 мл 0.32 М сахароза 0,01 М трис-буфере, рН 7,3 және 1 мл 0.003 М CaCl2 в 0.01 М трис-буфере, рН 7,3. Центрифугировали кезінде 5000 об/мин 20 мин центрифугалайды К-24. — Алынған осадку добавляли 1 мл 0.01 М трис-буфер рН 7,3 және қиратты да клеткалар шыны гомогенизаторе Поттера 2 мин («мұзды моншада), добавляли 3 мл 0.01 М трис-буфер қалдырғанын 30 мин. — «мұзды моншада. Центрифугировали ішінде 15 мин кезінде 2300 об/мин, 4°С (Eppendorf 5810R), жұмыстарды таңдап алды супернантант. Тұнба промывали 1 мл 0.01 М трис-буфере және центрифугировали ішінде 15 мин кезінде 2300 об/мин (Eppendorf 5810R). Жинап супернатант. Рәсімін қайталады тағы бір рет. супернатанты объединяли, осылайша, алынған «постядерный» супернатант. Дайындаған ерітінді фиколла (r=1.080 г/см). Алынған ерітіндіні центрифугировали кезінде 19500 об/мин 10 мин центрифугалайды Beckman (роторы бар SW55). Үстінен алынған градиенті перколла наслаивали 2.5 мл «постядерного супернатанта және центрифугировали кезінде 19500 об/мин 35 мин. Жою үшін фиколла, центрифугировали кезінде 45000 об/мин 2,5 сағат бойы 4°С, бұл ретте образовывался тығыз тұнба фиколла.
Надосадочную сұйықтық мазмұндалған секреторные түйіршіктер, жұмыстарды таңдап алды одан әрі жұмыс істеу үшін.
Электрофорез. Диск-электрофорез шығарып денатурирующих (ДСН) 8% разделяющем суықтық.
Алдымен жинап камераны үшін электрофорез (BioRad). Содан кейін дайындады 8% разделяющий гель схемасы бойынша:
Қосалқы ерітінді акриламида5,5 мл,дН2О9,5 млБуфер үшін бөлісетін гель (0,4% ДСН) 5,0 млТЕМЕД100 мкл10% ПСА100 мкл
Разделяющий гель заливали арасындағы әйнектері камера қарастыруға жеткізбей, жоғарысына дейін 2 см қалдырып полимеризоваться 40 мин.
Дайындады 4,5% концентрирующий гель схемасы бойынша:
Қосалқы ерітінді акриламида1,0 мл,дН2О2,75 млБуфер үшін концентрирующего гель (0,4% ДСН) 1,25 млТЕМЕД50 мкл,10% ПСА50 мкл
Наносили концентрирующий гель үстіне қатып қалған бөлісетін гель және вставили гребенку. Қалдырды полимеризоваться 20 мин.
Кейін полимерлеу орнатуы шыны камераны электрофорез аппараты, заливали камераны электродным буферінің арқылы тазалап, гребенку.
Үлгілерін дайындады схемасы бойынша:
Үлгісі (1мг/мл) Х50 мклБуфер үшін проб5мклБФС5 мкл
Сынама прогревали су моншасында кезінде 96ОС 3 минут ішінде, кейіннен суыту дейін 20 ГРАДУС С.
Режимі электрофорез:
Адамдар да қалташа және 20 мкл-ден сынама.

Добавить комментарий

Your email address will not be published.